刚刚，华裔科学家、哈佛大学教授刘如谦（David R. Liu）团队，再发 Nature。
他们证明，人工智能（AI）驱动的蛋白质重新设计，结合实验室连续进化，可以获得针对非天然靶点、同时具备高稳定性、高催化效率和高特异性的蛋白酶。
论文链接：https://www.nature.com/articles/s41586-026-10820-0
具体而言，他们先利用 AI 蛋白质设计模型 ProteinMPNN 对天然蛋白酶进行序列重设计，获得稳定性更高且保持原有催化效率的蛋白酶变体，随后再以 AI 设计变体和对应天然蛋白酶为起点，开展并行的噬菌体辅助连续进化（PACE）实验。结果显示，基于 AI 设计的 BoNT/E 不仅保留了新底物特异性，还提升了表达、稳定性和可进化性；AI 重新设计后的蛋白酶不仅修复了 PTEN 靶向变体的稳定性损失，还支持获得更高活性的新底物变体，并进化出了高特异性的 ataxin-2 靶向蛋白酶。
这种“先设计稳定性，再进化功能”的工作流，对蛋白质科学具有广泛意义，有望拓展蛋白酶治疗的应用范围，成为蛋白质工程中的通用范式，加速新酶、新型治疗蛋白以及其他功能蛋白的开发。
AI发现了新进化起点
过去，天然酶通常被直接作为定向进化起点，但其本身稳定性有限；经过人工改造或实验室定向进化获得的蛋白质，常面临稳定性、催化活性或特异性不足的问题。
不同于直接从天然酶开始做定向进化，研究团队先通过计算设计获得更稳定、表达更高的 BoNT 蛋白酶，再将这些设计蛋白酶作为自动化连续进化的起点，筛选能够切割新底物的变体。具体流程如下：
1. 计算设计：获得稳定化 BoNT 蛋白酶
研究团队以 BoNT/E 为模型，使用 AI 模型 ProteinMPNN 重新设计蛋白酶序列：保留底物识别和催化所需的关键残基，其余位点由 AI 重新生成，并用 AlphaFold2 评估结构。随后，他们对 AI 设计变体进行表达、纯化和活性测试。结果显示，多数 AI 设计变体能切割天然底物 SNAP25，其中 D1、D2 和 D3 三个变体综合表现更优，最高催化效率达到野生酶的2.8 倍。
为检验结果是否依赖 ProteinMPNN，他们还用 PROSS 重新设计 BoNT/E，也获得了表达、稳定性和酶动力学改善的变体。他们将这一流程拓展到其他 BoNT 蛋白酶，包括 BoNT/F 和 BoNT/X，结果同样保留或提高了催化效率。
2. PACE 进化：获得新底物切割能力
获得稳定化变体后，研究团队比较了 AI 设计变体 D3 与天然酶作为进化起点的适用性。他们先让两类起点分别适应三个越来越难切割的新底物 415、413 和 412，并用 PACE 持续筛选更高活性的变体。结果显示，AI 设计变体在三个新底物上都获得了更高活性，且在最难底物 412 上成功率更高。突变互换实验还表明，部分有益突变只在 AI 设计背景下有效，不能直接用于天然酶。
随后，他们进一步尝试让 BoNT/E 切割 ataxin-2。他们分别从天然酶和 AI 设计蛋白酶出发，用 PACE 筛选 ataxin-2 切割变体，并通过酶学和细胞实验验证这些变体的活性与选择性。
图｜计算蛋白质序列设计与连续进化整合流程概览，以及稳定化 BoNT/E 蛋白酶的重新设计。
比“天然酶”更好
整体来看，基于 AI 设计的蛋白酶在保留新底物特异性的同时，提高了表达水平、稳定性和可进化性。这一改造修复了 PTEN 靶向变体的稳定性损失，也支持获得更高活性的新底物变体，并进一步进化出高特异性的 ataxin-2 靶向蛋白酶。具体结果如下：
1.改善已有进化蛋白酶
AI 重新设计可以提高已有进化酶的表达和稳定性。此前，的 PTEN 切割变体 E(4130)A2 表达低、稳定性差。于是，研究团队把其中的进化突变移植到 AI 重新设计得到的 D1、D2 和 D3 中。结果显示，新蛋白酶既保留了 PTEN 切割能力，也没有重新切割原本的天然底物 SNAP25。
同时，新蛋白酶的表达水平明显提高：移植后的 D1、D2 和 D3 变体在大肠杆菌中的表达量提高了 2.2 至 5.2 倍；在 HEK293T 细胞中，D2 和 D3 变体表达量提高超过 24 倍，PTEN 切割产物分别增加 4.5 倍和 3.9 倍。
图｜将 PACE 进化得到的 BoNT/E 突变与 ProteinMPNN 重新设计结合，可提高重新编程 PTEN 切割型 BoNT/E 蛋白酶变体的表达水平和活性。
2.提升新底物进化效果
AI 设计起点在新底物进化中表现更好。研究团队比较了 D3 和天然 BoNT/E 在三个新底物 415、413 和 412 上的 PACE 进化结果。结果显示，D3更容易进化出高活性变体，稳定化设计改善了后续进化效果。
D3 在最难底物 412 上优势最明显。天然酶四组实验中只有两组得到有效变体，而 D3 四组全部成功；D3 变体的 PACE 回路激活达到 16 至 20 倍，高于天然酶变体约 10 倍。突变互换实验进一步显示，部分有益突变只在 AI 设计蛋白酶中有效，在天然酶中无法发挥同样作用。
3.扩展蛋白酶进化空间
重新设计起点能让蛋白酶获得不同于天然酶的突变组合。以底物 413 为例，D3 在进化过程中富集了一些天然酶中少见的突变组合，说明 AI 设计后的蛋白酶可以探索不同的功能序列空间。
图｜基因型分布，以及中等难度进化过程中起始点特异性突变组合的变化。
为评估其他设计蛋白酶是否也能作为有效进化起点，研究团队进一步测试了两个替代重新设计起点：ProteinMPNN 设计变体 D4 和 PROSS 设计变体 PROSS1。结果显示，D4 和 PROSS1 均能在三个新底物上通过 PACE 选择，并形成不同于天然酶和 D3 的进化基因型。
在这些替代起点中，D4 的初始催化速度比天然酶低约 20 倍，但进化后仍获得了与其他设计起点相当、甚至更高的活性。总体来看，三种重新设计起点产生的进化变体，活性均于天然酶起点。
图｜替代重新设计起点的进化，以及对进化基因型在所有起始背景中功能的综合评估。
4. 进化 ataxin-2 靶向蛋白酶
序列重新设计起点产生了更快、特异性更强的 ataxin-2 切割变体。研究团队通过 PACE 比较了天然酶起点和序列重新设计起点的进化结果。ataxin-2 是一种与神经退行性疾病相关的蛋白，BoNT/E原本不会切割它。他们选择其 1181-1201 位残基作为新的切割区域，这一区域与异常蛋白聚集有关。
相比从天然酶出发得到的变体，序列重新设计起点产生的 D3 进化变体切割 ataxin-2 更快，速度提高 1.4-1.7 倍；同时，它们没有检测到对天然底物 SNAP25 的切割。在 HEK293T 细胞中，序列重新设计起点得到的变体表达更高，产生的 ataxin-2 切割产物更多，副产物也更少。
图｜将序列重新设计蛋白酶与野生型蛋白酶分别重新编程，使其优先切割治疗相关的非天然靶标，而非天然靶标。
还有一些不足
不过，研究团队也指出，该方法虽然有望推广到更多酶和蛋白功能，但目前仍存在不足。具体如下：
首先，这项研究主要围绕 BoNT/E 蛋白酶展开，它更适合能够通过序列重新设计提高稳定性、并且功能可以在 PACE 中被选择的蛋白。类似优势能否出现在其他蛋白，仍需要更多验证。
其次，ataxin-2 靶向蛋白酶目前仍处于工具酶和早期应用验证阶段。他们表示，这类设计进化酶可用于研究在蛋白水平上破坏致病性 ataxin-2 包涵体，是否能够改善神经退行性疾病相关表型，仍有待后续研究推进。
最后，对于重新编程蛋白酶来说，安全性仍是未来应用中的关键问题。尤其是在切割非天然靶标时，除了提高目标切割效率，未来还需要尽可能减少对天然底物的切割，并系统评估潜在脱靶效应、细胞毒性、递送方式和免疫安全性。
更多技术细节，详见原论文。
作者：夏千斯
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